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RNAi干擾檢測

簡要描述:RNAi干擾檢測 是指(zhi)在進化過程中高度保(bao)守的、由(you)雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性(xing)降解的現象。

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  • 廠商性質:生產廠家
  • 更新時間:2023-07-20
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      RNAi干擾檢測 是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。基因沉默,主要有轉錄前水平的基因沉默(TGS)和轉錄后水平的基因沉默(PTGS)兩類:TGS是指由于DNA修飾或染色體異染色質化等原因使基因不能正常轉錄;PTGS是啟動了細胞質內靶mRNA序列特異性的降解機制。有時轉基因會同時導致TGS和PTGS。

  RNAi干擾檢測 主體實驗:
  一、成功將siRNA表達(da)載體導(dao)入(ru)目的細胞
  如果目的(de)細胞(bao)的(de)質(zhi)粒轉(zhuan)染效率(lv)較低(低于70%),則(ze)應采用(yong)腺病毒或慢病毒載(zai)體,利用(yong)病毒載(zai)體的(de)高(gao)感染率(lv)、高(gao)表達特性,更好地開展RNA干擾主體實驗。
  二、設(she)置(zhi)好分組(zu)和對照
  按照nature的標準(zhun),一個嚴格的RNAi介導knockdown實驗要(yao)有6個對照:
  ⒈轉(zhuan)染(ran)試劑(ji)對(dui)照(監控轉(zhuan)染(ran)及培養條(tiao)件對(dui)結果的影響);
  ⒉nonsense siRNA對照(監(jian)控外源核酸本身對結(jie)果的影響(xiang));
  ⒊positive siRNA對照(監(jian)控假(jia)陰性);
  ⒋技(ji)術(shu)重復對照(也(ye)(ye)叫off-target 對照,也(ye)(ye)就(jiu)是(shi)利用至少2個靶點的(de)siRNA同時(shi)實驗,2個siRNA互為off-target control,當兩(liang)者的(de)表型相同時(shi),才有可能是(shi)特異性(xing)的(de)knockdown效應);
  ⒌rescue 對(dui)照(zhao)(knockdown之后做超表達(da),看是否(fou)有性(xing)狀(zhuang)的逆(ni)轉(zhuan)(zhuan),這也(ye)是為了說明knockdown的特異性(xing));6.全表達(da)組(zu)掃描(miao)對(dui)照(zhao)(就是轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)/表達(da)芯(xin)片掃描(miao),以zui終(zhong)確定(ding)表型不是由于(yu)off-target造成)。
  實(shi)(shi)際(ji)實(shi)(shi)驗(yan)中(zhong),全表達組掃描對照(zhao)(zhao)很(hen)少有(you)文獻涉及。其它幾(ji)個對照(zhao)(zhao)中(zhong),1,2兩(liang)種對照(zhao)(zhao)即所謂(wei)(wei)的(de)空白細胞對照(zhao)(zhao)、NC對照(zhao)(zhao),基(ji)本是(shi)所有(you)雜志都要求具備的(de)。4,5兩(liang)種對照(zhao)(zhao),主要是(shi)為了(le)解決off-target效(xiao)應,選做一種即可,一般建議選5,涉及的(de)實(shi)(shi)驗(yan)即所謂(wei)(wei)的(de)“RNA干(gan)擾回復實(shi)(shi)驗(yan)”,
  三、RNA干(gan)擾(rao)效率的檢(jian)測(體(ti)外)
  一般應該從(cong)mRNA水(shui)(shui)平、蛋白質水(shui)(shui)平、細胞表型水(shui)(shui)平三個層次(ci)來(lai)檢測(ce)干擾效率。
  mRNA水(shui)(shui)平:RT-PCR、Real-time PCR;蛋(dan)白質水(shui)(shui)平:Western-blot、ELISA、免(mian)疫組化(hua);細胞(bao)表型水(shui)(shui)平:MTT、克(ke)隆形成實驗(yan)、流式(shi)細胞(bao)檢測、細胞(bao)小(xiao)室實驗(yan)等(deng)。RNA干擾效率在動物模型上的進一(yi)步(bu)驗(yan)證(zheng)(體內) 動物模型實驗(yan)可以采取“體內法”和“體外法”。
  體(ti)內法,即(ji)先(xian)做裸鼠(shu)成瘤模型,再(zai)將質(zhi)粒或病(bing)毒(du)導入(ru)裸鼠(shu),檢測RNA干擾效(xiao)果。此(ci)法操(cao)(cao)作復雜,對質(zhi)粒和(he)病(bing)毒(du)產品(pin)的(de)質(zhi)和(he)量(liang)要(yao)求(qiu)都較(jiao)高(gao),但是比較(jiao)貼近實際,說服(fu)力較(jiao)顯著。體(ti)外(wai)法,即(ji)先(xian)將質(zhi)粒或病(bing)毒(du)導入(ru)腫瘤細胞(bao),再(zai)將腫瘤細胞(bao)導入(ru)動物體(ti)內,然后(hou)檢測RNA干擾效(xiao)果。此(ci)法操(cao)(cao)作較(jiao)簡單(dan),對質(zhi)粒和(he)病(bing)毒(du)產品(pin)的(de)質(zhi)量(liang)要(yao)求(qiu)較(jiao)低,所以為大多數(shu)文獻所采(cai)用。建議(yi)采(cai)用此(ci)方(fang)法來進行動物模型水(shui)平的(de)實驗。

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