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RNA抽提

簡要描(miao)述(shu):RNA可分為信使RNA、轉(zhuan)運RNA和核糖體(ti)RNA三大類,不同組織(zhi)總RNA提(ti)取實質就是(shi)將細胞裂(lie)解,釋放出RNA,并通過不同方式(shi)去(qu)除蛋白、DNA等雜質,Z終(zhong)獲得高(gao)純RNA產(chan)物的過程。 由(you)于RNA樣品易受(shou)環境因(yin)素特別是(shi)RNA酶(mei)的影響而降解,提(ti)取高(gao)質量的RNA樣品在生(sheng)命(ming)科研中(zhong)具有相當的挑戰性(xing)。RNA提(ti)取對樣品的新鮮性(xing)要求非常高(gao),獲取樣品后立(li)即提(ti)取RNA,若無(wu)條(tiao)件(jian)立(li)即實驗(yan),應于-80℃或液氮(dan)中(zhong)。

  • 產品型號:
  • 廠商性質:生產廠家
  • 更(geng)新(xin)時間:2023-07-20
  • 訪(fang)  問  量:1544
 RNA抽提操作步驟:
  1. 勻漿處理:
  a.組(zu)織 將(jiang)組(zu)織在(zai)液氮中磨碎,每50-100mg組(zu)織加(jia)入1ml TRIzol,用勻(yun)漿(jiang)儀進行勻(yun)漿(jiang)處理。樣品體(ti)積不應超過(guo)TRIzol體(ti)積10℅。
  b.單層培(pei)養細(xi)胞(bao) 直接在(zai)培(pei)養板中加入(ru)TRIzol裂解細(xi)胞(bao),每10cm2面積(ji)(ji)(即3.5cm直徑的(de)培(pei)養板)加1ml,用移液器吸打幾次(ci)。TRIzol的(de)用量應根(gen)據培(pei)養板面積(ji)(ji)而定,不取(qu)決于細(xi)胞(bao)數。TRIzol加量不足可能導致(zhi)提取(qu)的(de)RNA有DNA污染。
  c.細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)懸(xuan)液 離心(xin)收集(ji)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao),每5-10×106動物(wu)、植(zhi)物(wu)、酵母細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)或1×107細(xi)(xi)菌(jun)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)加入(ru)1ml TRIzol,反復吸(xi)打。加TRIzol之前不要洗(xi)滌細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)以免mRNA降(jiang)解。一(yi)些酵母和細(xi)(xi)菌(jun)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)需(xu)用勻漿儀處理。
  2.將(jiang)勻漿樣品(pin)在室(shi)溫(15-30℃)放(fang)置(zhi)5分鐘,使核酸蛋白復合物*分離。
  3.可選(xuan)步(bu)驟:如樣品中(zhong)含有較多蛋白質,脂(zhi)肪(fang)(fang),多糖或胞(bao)外物(wu)質(肌肉,植物(wu)結節部分等)可于2-8℃10000×g離心10分鐘(zhong),取(qu)上清。離心得(de)到的沉淀(dian)中(zhong)包括細胞(bao)外膜(mo),多糖,高分子量(liang)(liang)DNA,上清中(zhong)含有RNA。處理脂(zhi)肪(fang)(fang)組(zu)織時,上層有大量(liang)(liang)油(you)脂(zhi)應去除。取(qu)澄(cheng)清的勻(yun)漿液(ye)進行下一步(bu)操作。
  5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,劇(ju)烈(lie)振(zhen)蕩15秒(miao),室溫放置3分鐘(zhong)。
  6. 2-8℃10000×g離心15分(fen)鐘。樣品分(fen)為三層(ceng):底層(ceng)為黃色有(you)機相(xiang)(xiang),上層(ceng)為無色水(shui)相(xiang)(xiang)和一個中間層(ceng)。RNA主要在水(shui)相(xiang)(xiang)中,水(shui)相(xiang)(xiang)體積約為所用TRIzol試(shi)劑的60℅。
  7. 把水相轉移(yi)到新(xin)管中,如要分離DNA和蛋(dan)白質可保留有(you)機相,進一(yi)步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使(shi)用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。
  8. 2-8℃10000×g離(li)心10分鐘,離(li)心前看不出RNA沉淀,離(li)心后在管(guan)(guan)側和管(guan)(guan)底出現(xian)膠(jiao)狀沉淀。移去上清。
  9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀(dian)。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離(li)心5分鐘,棄上(shang)清。
  10.室溫(wen)放置干(gan)燥(zao)或(huo)真(zhen)空抽干(gan)RNA沉淀,大(da)約晾5-10分(fen)鐘即(ji)可(ke).不要真(zhen)空離心干(gan)燥(zao),過于干(gan)燥(zao)會導致RNA的溶解性大(da)大(da)降低。加入25-200μl無RNase的水或(huo)0.5℅SDS,用(yong)槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分(fen)鐘使(shi)RNA溶解.如RNA用(yong)于酶切反(fan)應,勿使(shi)用(yong)SDS溶液。RNA也可(ke)用(yong)100℅的去(qu)離子甲酰胺溶解,-70℃保存。

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