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TA克隆

簡要(yao)描述:TA克(ke)隆(clone):無(wu)性繁殖——應用(yong)酶(mei)學的(de)方法,在(zai)體外將目的(de)基(ji)因與載體DNA結(jie)合成具有自(zi)我(wo)復制能力的(de)DNA分子(重(zhong)組子),再通過轉化(hua)或轉染宿主細胞、篩選(xuan)出含有目的(de)基(ji)因轉化(hua)子,進行擴增、提取(qu)獲得大量同一DNA,或其(qi)表達產(chan)物。

  • 產品型(xing)號(hao):
  • 廠商性質:生產廠家
  • 更新時間:2023-07-19
  • 訪  問  量:2632

TA克隆實驗原理 

  TA克(ke)隆(long)是利用耐熱(re)聚合(he)酶(mei),如Taq聚合(he)酶(mei)、Tfl、Tth等具(ju)(ju)有末(mo)端(duan)轉移酶(mei)活(huo)性(xing),而(er)不具(ju)(ju)有3 一5外切酶(mei)的(de)校準活(huo)性(xing),即(ji)在PCR產(chan)物(wu)的(de)兩個3 末(mo)端(duan)加上未(wei)配對(dui)的(de)單一A凸(tu)出尾 ,質粒載(zai)體提供線性(xing)3末(mo)端(duan)單一的(de)T凸(tu)出尾,使(shi)該載(zai)體能夠直接與PCR產(chan)物(wu)高效連接。技(ji)術比(bi)其(qi)它(ta)PCR克(ke)隆(long)方(fang)法有更(geng)高的(de)重組效率。

只需4個(ge)步驟:①擴(kuo)增目的PCR產物;②制(zhi)備T克(ke)隆(long)載體(ti);③PCR產物直接克(ke)隆(long)至(zhi)T載體(ti)上④轉化并篩選重組子。

 

實驗步驟

(1)擴增后的PCR產物與T載體的連接(jie)

取1只無菌Ep管、用微量進(jin)樣器按下列順序加入各(ge)成分。

10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul

PCR產物(wu)約(yue)0.3 pmol

T載體約(yue)0.03pmol

T4 DNA Ligase 1ul

ddH2O 加至 25ul

*1 DNA的摩爾(er)數應(ying)控制(zhi)在載體DNA摩爾(er)數的3-10倍。

*2 相同末端的載體與DNA進行連(lian)接時,應首先將載體進行去磷酸化(hua)(hua)處理,以防止其自身環化(hua)(hua)。

(2)蓋(gai)(gai)好蓋(gai)(gai)子(zi),用手(shou)指(zhi)輕彈Ep管數次,并于臺式離心機離心2s 以集中(zhong)溶液。

(3)將(jiang)反應管放入4℃金屬浴中反應20h。

(4)取出約(yue)2ul的DNA連(lian)接(jie)液進行瓊脂糖凝膠電(dian)泳(yong),鑒定連(lian)接(jie)結(jie)果,與(yu)未經連(lian)接(jie)的質粒(li)DNA和酶切DNA一同作(zuo)電(dian)泳(yong)。

(5)用0.1×TE將連接混合物稀釋至50ul,使(shi)用10ul轉化大腸桿菌感(gan)受態細胞。

(6)通過Amp抗性來篩(shai)選(xuan)轉化(hua)(hua)子,轉化(hua)(hua)子擴增后,可將(jiang)轉化(hua)(hua)的質粒提取出,進行(xing)電泳、酶切等進一步鑒定。

 

 

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