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目的基因亞克隆

簡要描(miao)述:對已(yi)經獲得的(de)目(mu)的(de)DNA條帶(dai)進(jin)行(xing)重新(xin)克(ke)隆(long),其(qi)目(mu)的(de)在于對目(mu)的(de)DNA進(jin)行(xing)進(jin)一(yi)步分析,或者進(jin)行(xing)重組(zu)改造等。亞克(ke)隆(long)的(de)基本過程包括(kuo):(1)目(mu)的(de)DNA條帶(dai)和(he)載體的(de)制備(bei);(2)目(mu)的(de)DNA條帶(dai)和(he)載體的(de)連(lian)接(jie);(3)連(lian)接(jie)產物的(de)轉化(hua);(4)重組(zu)子(zi)篩選。

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  • 廠商性(xing)質:生產廠家
  • 更新時(shi)間:2023-07-19
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亞克隆

已經獲(huo)得的目(mu)(mu)的DNA條帶進(jin)(jin)(jin)行重新克(ke)隆,其目(mu)(mu)的在于對(dui)目(mu)(mu)的DNA進(jin)(jin)(jin)行進(jin)(jin)(jin)一步分析(xi),或者進(jin)(jin)(jin)行重組改(gai)造等。

亞克隆的基本過程包括:

(1)目的(de)(de)DNA條(tiao)帶和載體的(de)(de)制備(bei);(2)目的(de)(de)DNA條(tiao)帶和載體的(de)(de)連(lian)接(jie);(3)連(lian)接(jie)產物的(de)(de)轉(zhuan)化;(4)重組(zu)子篩選。

目的DNA條帶和載體的制備
    選擇適宜的(de)限(xian)制(zhi)性(xing)(xing)核酸內切(qie)酶,消(xiao)化(hua)已知目的(de)DNA和(he)載體(ti)(ti),獲得線性(xing)(xing)DNA,用于重組。根據目的(de)DNA和(he)載體(ti)(ti)的(de)具體(ti)(ti)情況,選擇一(yi)種(zhong)(zhong)或(huo)者(zhe)兩(liang)種(zhong)(zhong)適當(dang)的(de)限(xian)制(zhi)酶切(qie)割,分(fen)別產(chan)(chan)生對稱性(xing)(xing)粘(zhan)性(xing)(xing)末(mo)端(duan)(duan)(duan)(用一(yi)種(zhong)(zhong)限(xian)制(zhi)性(xing)(xing)內切(qie)酶進(jin)行消(xiao)化(hua)而產(chan)(chan)生帶有(you)互補突出(chu)端(duan)(duan)(duan))、不(bu)(bu)對稱粘(zhan)性(xing)(xing)末(mo)端(duan)(duan)(duan)(用兩(liang)種(zhong)(zhong)不(bu)(bu)同的(de)限(xian)制(zhi)性(xing)(xing)內切(qie)酶進(jin)行消(xiao)化(hua)而產(chan)(chan)生帶有(you)非互補突出(chu)端(duan)(duan)(duan))、平(ping)端(duan)(duan)(duan)。在(zai)亞克隆時(shi),*不(bu)(bu)對稱相容末(mo)端(duan)(duan)(duan)連(lian)(lian)接,次選對稱性(xing)(xing)粘(zhan)性(xing)(xing)相容性(xing)(xing)末(mo)端(duan)(duan)(duan)連(lian)(lian)接,由于平(ping)末(mo)端(duan)(duan)(duan)連(lian)(lian)接效率較低,通常很少采用。但有(you)時(shi)目的(de)片段的(de)末(mo)端(duan)(duan)(duan)與載體(ti)(ti)不(bu)(bu)匹(pi)配(pei) ,一(yi)般先將不(bu)(bu)匹(pi)配(pei)末(mo)端(duan)(duan)(duan)補平(ping),然后再以平(ping)末(mo)端(duan)(duan)(duan)連(lian)(lian)接。

利用T4 DNA連接酶進行目的DNA條帶和載體的體外連接

外源DNA條(tiao)帶末端(duan)性(xing)質

連接要求

          連接(jie)結果

不對稱粘性末端

兩種限制酶消化后,需純化載(zai)體(ti)以提高連接效率

載(zai)體(ti)與外源DNA連接處的限制(zhi)酶切(qie)位點(dian)常(chang)可保留;非重組克隆(long)的背景較低;外源DNA可以定向插入到載(zai)體(ti)中。

對稱性粘性末端

線形載(zai)體DNA常需磷酸酶(mei)脫磷處理

載體與外(wai)源(yuan)DNA連接處(chu)的限制酶切位點常(chang)可保留(liu);重組質粒會(hui)帶有(you)外(wai)源(yuan)DNA的串(chuan)聯(lian)拷貝;外(wai)源(yuan)DNA會(hui)以兩個方向插入到(dao)載體中(zhong)。

平端

要(yao)求高濃度的DNA和連(lian)接(jie)酶

載(zai)體與外源DNA連接處的限制酶切(qie)位點消失(shi);重(zhong)組(zu)(zu)質(zhi)粒會帶有外源DNA的串聯拷貝(bei);非(fei)重(zhong)組(zu)(zu)克(ke)隆的背景較(jiao)高(gao) 。

連接產物的轉化
⑴ 取100μl貯存于-70℃鈣化菌,冰浴化開;
⑵ 加入適量連接產物(一般不超過10μl,輕輕混勻,冰浴20min;
⑶ 于42℃熱休克90s,迅速轉移至冰浴中,繼續冰浴2-3min;
⑷ 加入LB液體培養基200μl,于37℃緩搖孵育45min;
⑸ 將培(pei)養物(wu)適量涂(tu)于(yu)1.5%瓊脂LB平板(ban)(根據(ju)質粒性質添加抗生素或(huo)/和X-Gal/IPTG),待膠表面沒有液體流動(dong)時(shi),37℃溫箱倒置培(pei)養12-16hr。

重組子的篩選
   根據(ju)載體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)遺傳(chuan)特征(zheng)篩選重(zhong)(zhong)(zhong)組(zu)(zu)子,如(ru)α-互(hu)補(bu)、抗生(sheng)(sheng)素(su)基因等。現在(zai)使(shi)用(yong)的(de)(de)(de)(de)許多(duo)載體(ti)(ti)都帶有(you)一個(ge)大腸(chang)桿菌的(de)(de)(de)(de)DNA的(de)(de)(de)(de)短區(qu)段(duan),其中有(you)β-半乳(ru)糖苷酶基因(lacZ)的(de)(de)(de)(de)調(diao)控序列和(he)前146個(ge)氨(an)(an)基酸的(de)(de)(de)(de)編(bian)(bian)(bian)碼(ma)信息。在(zai)這(zhe)(zhe)個(ge)編(bian)(bian)(bian)碼(ma)區(qu)中插(cha)入了(le)一個(ge)多(duo)克隆位點(MCS),它(ta)并不(bu)破壞讀框,但可使(shi)少數(shu)幾個(ge)氨(an)(an)基酸插(cha)入到β-半乳(ru)糖苷酶的(de)(de)(de)(de)氨(an)(an)基端(duan)而(er)不(bu)影響(xiang)功能,這(zhe)(zhe)種載體(ti)(ti)適(shi)用(yong)于(yu)可編(bian)(bian)(bian)碼(ma)β-半乳(ru)糖苷酶C端(duan)部分(fen)序列的(de)(de)(de)(de)宿(su)主(zhu)細(xi)胞。因此,宿(su)主(zhu)和(he)質(zhi)(zhi)粒編(bian)(bian)(bian)碼(ma)的(de)(de)(de)(de)片段(duan)雖都沒有(you)酶活(huo)性(xing),但它(ta)們(men)同時存(cun)在(zai)時,可形(xing)(xing)成(cheng)具有(you)酶學(xue)活(huo)性(xing)的(de)(de)(de)(de)蛋白質(zhi)(zhi)。這(zhe)(zhe)樣,lacZ基因在(zai)缺少近操(cao)縱基因區(qu)段(duan)的(de)(de)(de)(de)宿(su)主(zhu)細(xi)胞與帶有(you)完整近操(cao)縱基因區(qu)段(duan)的(de)(de)(de)(de)質(zhi)(zhi)粒之間(jian)實現了(le)互(hu)補(bu),稱(cheng)為α-互(hu)補(bu)。由α-互(hu)補(bu)而(er)產(chan)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)(de)LacZ 細(xi)菌在(zai)誘導劑IPTG的(de)(de)(de)(de)作用(yong)下,在(zai)生(sheng)(sheng)色底物(wu)X-Gal存(cun)在(zai)時產(chan)生(sheng)(sheng)藍(lan)(lan)色菌落,因而(er)易于(yu)識別。然(ran)而(er),當外源DNA插(cha)入到質(zhi)(zhi)粒的(de)(de)(de)(de)多(duo)克隆位點后,幾乎不(bu)可避免地導致(zhi)無α-互(hu)補(bu)能力的(de)(de)(de)(de)氨(an)(an)基端(duan)片段(duan),使(shi)得(de)帶有(you)重(zhong)(zhong)(zhong)組(zu)(zu)質(zhi)(zhi)粒的(de)(de)(de)(de)細(xi)菌形(xing)(xing)成(cheng)白色菌落。這(zhe)(zhe)種重(zhong)(zhong)(zhong)組(zu)(zu)子的(de)(de)(de)(de)篩選,又稱(cheng)為藍(lan)(lan)白斑篩選。如(ru)用(yong)藍(lan)(lan)白斑篩選則(ze)經連接產(chan)物(wu)轉化的(de)(de)(de)(de)鈣化菌平板37℃溫箱倒置(zhi)培養(yang)12-16hr后,有(you)重(zhong)(zhong)(zhong)組(zu)(zu)質(zhi)(zhi)粒的(de)(de)(de)(de)細(xi)菌形(xing)(xing)成(cheng)白色菌落。

 

 

 

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