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Western 免疫印跡

簡要(yao)描述:Western免疫(yi)印跡(Western Blot)是將(jiang)蛋白(bai)質轉移到膜上(shang),然后利用(yong)抗體(ti)進行檢(jian)(jian)測。對(dui)已知表達蛋白(bai),可(ke)用(yong)相應抗體(ti)作為一抗進行檢(jian)(jian)測,對(dui)新基因的表達產(chan)物(wu),可(ke)通過融合部分的抗體(ti)檢(jian)(jian)測。

  • 產品型號:
  • 廠(chang)商性質:生產廠家
  • 更新時間:2023-07-19
  • 訪  問  量:1912

Western免疫印跡

    Western Blot采用(yong)的(de)是聚丙烯酰胺凝膠電(dian)泳(yong),被檢測物是蛋(dan)白(bai)質,“探針”是抗(kang)(kang)體(ti)(ti),“顯(xian)色”用(yong)標記(ji)的(de)二抗(kang)(kang)。經(jing)過PAGE分離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)質樣品,轉移到固(gu)相載體(ti)(ti)(例(li)如(ru)硝酸纖維(wei)素薄膜)上,固(gu)相載體(ti)(ti)以非共價鍵形式吸附蛋(dan)白(bai)質,且能保持電(dian)泳(yong)分離(li)的(de)多(duo)肽類型及其(qi)生物學活性不變(bian)。以固(gu)相載體(ti)(ti)上的(de)蛋(dan)白(bai)質或多(duo)肽作為抗(kang)(kang)原(yuan),與對應的(de)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)起免疫反應,再(zai)與酶或同位素標記(ji)的(de)第二抗(kang)(kang)體(ti)(ti)起反應,經(jing)過底物顯(xian)色或放射自(zi)顯(xian)影(ying)以檢測電(dian)泳(yong)分離(li)的(de)特異性目的(de)基因表(biao)達的(de)蛋(dan)白(bai)成(cheng)分。該技術也廣泛應用(yong)于檢測蛋(dan)白(bai)水平的(de)表(biao)達。

Western Blot操作步驟
(一)蛋白質樣品獲得:細菌誘導表達后,可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細胞,真核細胞加勻漿緩沖液,機械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃,13,000g離心15min。取上清液作為樣品。
(二)電泳:制備電泳凝膠,進行SDS-PAGE。
(三)轉移:(半干式轉移)
1、電泳結束后將膠條割至合適大小,用轉膜緩沖液平衡,5min×3次。
2、膜處理:預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜,浸入轉膜緩沖液中10min。
3、轉膜:轉膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好,濾紙、凝膠、NC膜精確對齊,每一步去除氣泡,上壓500g重物,將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2,轉移1.5hr。轉移結束后,斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色,放入膜染色液中50s后,在50%甲醇中多次脫色,至背景清晰,然后用雙蒸水洗,風干夾于兩層濾紙中保存,留與顯色結果作對比。
(四)免疫反應:
1、用0.01M PBS洗膜,5min ×3次。
2、加入包被液,平穩搖動,室溫2hr。
3、棄包被液,用0.01M PBS洗膜,5min×3次。
4、加入一抗(按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋,液體必須覆蓋膜的全部),4℃ 放置12hr以上。陰性對照,以1%BSA取代一抗,其余步驟與實驗組相同。
5、棄一抗和1%BSA,用0.01M PBS分別洗膜,5min×4次。
6、加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗(按合適稀釋比例用0.01M  PBS稀釋),平穩搖動,室溫2hr。
7、棄二抗,用0.01M PBS洗膜,5min×4次。
8、加入(ru)顯色液(ye),避(bi)光顯色至出現(xian)條帶時放入(ru)雙(shuang)蒸水中終止反應。

Western Blot注意事項
1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經過預實驗確定*條件。
2、顯色液必須新鮮配置使用,zui后加入H2O2。
3、DAB有(you)致(zhi)癌的潛在可(ke)能,操作時(shi)要小心(xin)仔細。

 

 

 

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