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成功完成Western Blot檢測,必須滿足4個條件

  • 發布日期:2017-02-21      瀏覽次數:2964
    •    成功完成Western Blot檢測,必須滿足4個條件:
        凝膠洗脫:轉移期間蛋白質必須從凝膠中洗脫出來,如果蛋白質還截留在凝膠中,將無法在膜上進行分析。
        吸附到膜上:在轉移過程中蛋白質必須吸附到膜上,如果蛋白不吸附,將無法在膜上進行分析。
        處理期間仍截留在膜上:在轉移后的處理過程中蛋白質必須保持吸附在印跡膜上。
        處理過程中可接近:被吸附的蛋白質必須能夠與檢測試劑接觸,如果蛋白質被掩蓋則無法檢測。
        成功進行Western Blot檢測,則設置合適正確的對照是*的,只要正確設置了這些對照,即可快速和準確的找到WB的問題所在,并保證實驗結果的準確性和特異性!一般需要設置的對照如下:
        陽性對照:明確表達檢測蛋白的組織或細胞,用于檢測抗體的工作效率
        陰性對照:明確不表達檢測蛋白組織或細胞,用于檢測抗體的特異性
        二抗對照:不加一抗,用于檢測二抗的特異性
        內參對照:檢測標本的質量和二抗系統
        空白對照:不加一抗和二抗;用于檢測膜的性質和封閉的效果
        Western Blot檢測基本過程
        1、獲取細胞或組織裂解物
        1)根據檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer:
        )選擇合適的蛋白酶抑制劑,避免蛋白降解,從而保證檢測的準確性!
        2、蛋白定量
        常用的蛋白定量方法:Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后,可根據情況將標本保存在-20°C /-80°C備用,進行免疫沉淀(IP)或者直接進行電泳分離蛋白
        3、電泳分離蛋白質
        根據待測蛋白狀態確定電泳條件
        根據待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度
        4、轉膜
        根據不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合適的膜類型。常用的轉移膜類型有:PVDF膜、硝酸纖維素膜(NC膜)和尼龍膜,其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。
        5、封閉
        去掉膜上多余的非特異性結合位點,降低背景。常用的封閉溶液有:含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS
        6、一抗孵育
        一抗的選擇成功與否,是整個WB實驗成功的關鍵:選擇一抗有以下幾個注意點:
        選擇適合檢測標本種屬的一抗(說明書有驗證)
        選擇適用于WB實驗方法的一抗(說明書有驗證)
        選擇單克隆抗體或者經過親和純化的多克隆抗體
        一抗的保存和使用:
        根據說明書的要求條件進行抗體的保存;一般需要將抗體分裝后放入-20度保存,避免反復凍融。
        抗體的工作液現配現用,在4度保存不要超過2周
        根據說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實驗室條件和檢測方法等的差異,說明書推薦的稀釋比例只作參考,需要在說明書推薦的濃度周邊進行多個濃度梯度的實驗檢測,然后選擇信噪比的抗體濃度進行實驗。如果說明書沒有推薦濃度,可進行多個稀釋比例進行摸索*稀釋度(1:100-1:3000)。
        孵育條件:推薦4°C孵育過夜(一般大于18個小時),根據抗體親和力不同孵育時間有所區別
        內參的選擇和使用:WB過程監測以及目的蛋白定量的標準!
        7、二抗孵育
        根據說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有推薦濃度,可進行多個稀釋比例進行摸索*稀釋度(1:1000-1:20000)。孵育條件一般為室溫1-2小時
        8、底物孵育
        選擇顯色或者化學發光底物。一般傾向于化學發光,靈敏度高且背景低,節省抗體用量
        9、結果分析和檢測
        凝膠成像系統檢測或者暗室曝光到膠片
        Note:從封閉開始,每步之間都需要用TBST進行洗滌,3次,每次5min